Minuman Tuak Aren dari Indonesia Mengandung Enzim Fibrinolitik yang Baik untuk Kesehatan

Sebagai orang Indonesia, apakah kalian tau minuman tradisional tuak aren? Tuak aren merupakan minuman tradisonal beralkohol khas Sumatera Utara tepatnya di daerah Tapanuli. Minuman ini merupakan produk pangan hasil fermentasi. Bahan utama dari minuman ini adalah Nira. 

Nira adalah minum non -- alkohol dan non -- fermentasi yang dihasilkan dari getah pohon palem. Nira diolah menjadi tuak dengan proses fermentasi oleh kulit kayu raru (Vatica pauciflora blume) selama 2 hari untuk menghasilkan kandungan alkohol pada tuak aren, yaitu sekitar 3.8%. 

Selain itu, tuak aren juga mengandung proetein sekitar 0.05 -- 2%. Baik nira ataupun tuak berpotensi untuk menjadi sumber enzim fibrinolitik yang berasal dari mikroorganisme yang terkandung pada bahan alam tersebut (Johnson et al. 2015).

Adanya kandungan enzim fibrinolitik tersebut merupakan hal yang baik bagi kesehatan. Enzim fibrinolitik merupakan enzim yang penting untuk memecah dan mencegah pembekuan darah pada tubuh. Pembekuan darah dapat mengakibatkan penyakit karena menyumbat pembuluh darah arteri. 

Pembekuan darah tersebut terjadi karena adanya ruptur plak aterosklerosis di dinding pembuluh darah membentuk trombosis atau penggumpalan darah yang menyumbat pembuluh darah. 

Hal ini biasanya menyebabkan penyakit seperti infark miokard dan infark serebral yang dapat menyebabkan kematian. Kasus kematian akibat kondisi ini mencapai 7.200.000 di seluruh dunia pada tahun 2004 menurut WHO (World Health Organization) (Pananjung et al. 2015).

Enzim fibrinolitik bersifat aktif pada kondisi netral dan kondisi basa. Aktivitasnya optimal pada pH 8 -- 10. Berat molekul dari enzim fibrinolitik berada pada kisaran 27.7 hingga 44 kDa. 

Biasanya enzim ini dapat ditemukan dari hewan, tanaman, atau mikroorganisme (Sitasi 2). Kebanyakan enzim fibrinolitik diisolasi dari bakteri pada produk pangan hasil fermentasi, seperti dari Bacillus sp. pada produk pangan Jeot-gal asal Korea, B. amyloliquefaciens DC-4 dari makanan douchi asal China, dan Fusarium sp. dari produk pangan tempe dari Indonesia. 

Oleh karena itu, setiap produk pangan hasil fermentasi berpotensi sebagai sumber produsen enzim fibrinolitik, seperti tuak aren. Cara kerja dari enzom fibrinolitik dalam mengatasi pembekuan darah adalah dengan hidrolisis senyawa fibrin. 

Senyawa fibrin merupakan senyawa yang menyebabkan pembekuan darah. Dengan menghidrolisis senyawa tersebut, fibrin akan menjadi zat terlarut yang terbuang melewati peredaran darah dan mencegah terhambatnya pembuluh darah sehingga dinding pembuluh darah dapat memulai proses penyembuhan (Johnson et al. 2015).

Untuk mengisolasi enzim fibrinolitik dari tuak aren, digunakan berbagai macam metode dan langkah -- langkah. Hal pertama yang dilakukan adalah menumbuhkan bakteri dari sampel nira dan tuak aren pada media Luria Agar sebanyak 100 L dan diinkubasi pada 37oC overnight. 

Beberapa koloni yang terbentuk kemudian ditumbuhkan kembali pada agar skim milk (SMA media) dan diikubasi kembali pada suhu 37oC overnight. Koloni dari sampel tuak aren dan nira yang membentuk zona bening terbesar kemudian ditumbuhkan kembali atau dilakukan refreshment pada SMA media lagi dan diinkubasi lagi pada suhu 37oC overnight (Johnson et al. 2015).

Kedua, diproduksi enzim mentah dari koloni hasil refreshment yang kemudian dicampurkan pada media cair SM dan diinkubasi di suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam pada 120 rpm. Sebanyak 250 L hasil yang didapatkan kemudian dipipet ke dalam microtiter 4 kali perlakuan dan diukur konsentrasi protein dari enzim mentah menggunakan microplate reader ELISA pada panjang gelombang 620 nm. 

Pada conical tube, sisa enzim ditambahkan dengan natrium azida konsentrasi 0.2% dan disentrifugasi selama 15 menit pada 10.000 g di suhu 4oC. Setelah proses ini selesai, dilanjutkan dengan langkah berikutnya, yaitu mengidentifikasi keberadaan aktifitas enzim fibrinolitik dari sampel tuak aren yang telah diisolasi pada langkah sebelumnya (Johnson et al. 2015).

Untuk menguji apakah ada enzim fibrinolitk, dilakukan screening menggunakan teknik zimogram dengan substrat fibrinogen 0.1% w/v. Langkah ini diawali dengan membuat gel zimogram menggunakan 12% acrylamide dan 5% gel. 

Setelah dibentuk, sebanyak 10 hingga 20 L sampel dimasukkan ke dalam masing -- masing well. Buffer yang digunakan dalam analisis menggunakan zimogram ini adalah 2-mercaptoethanol yang kemudian diproses menggunakan alat elektroforesis selama 1.5 hingga 2 jam pada kekuatan 100 Volt dan 50 Ampere. 

Setelah proses elektroforesis selesai, gel zimogram yang telah terbentuk direndam selama 30 menit dalam Triton X-100 kemudian dibilas menggunakan aquades. Dilanjutkan dengan merendam kembali gel pada buffer fosfat 50mM dengan pH 8 dan suhu 37oC. 

Pewarnaan pada gel memanfaatkan Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 yang didiamkan selama 15 menit dan dilakukan destaining agar tervisualisasikan pita -- pita yang terbentuk dari sampel yang telah diinjeksi membentuk pita putih dengan latar berwarna biru (Johnson et al. 2015).

Enzim yang telah berhasil diekstraksi dan diidentifikasi menggunakan zimogram kemudian dapat dipurifikasi untuk mendapatkan enzim murni. 

Tahap purifikasi dimulai dengan memisahkan pelet dan supernatan dengan sentrifugasi selama 10 menit di suhu 40oC pada 12.000 g. Supernatan yang terbentuk kemudian difiltrasi menggunakan filter Sarsted 0.45 m dan disuspensi pada suhu 4oC overnight pada ammonium sulfate 80% w/v. 

Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan buffer fosfat 50 mM yang memiliki pH 7.8 dan didialisis dengan buffer 20 volume selama 24 jam pada suhu 4oC. 

Masukkan sampel pada freeze dry dan diresuspensi kembali pada buffer fosfat pH 7.8 50 mM. Sampel dipisahkan dengan menggunakan Hitrap DEAE FF column yang diekuilibrasi dengan buffer fosfat 50 mM yang hasil elusinya akan keluar secara linear dari 0 hingga 1 M NaCl dengan laju alir 1 mL per menitnya (Johnson et al. 2015).

Setelah didapatkan sampel enzim fibrinolitik, saatnya mengidentifikasi berat molekul dan aktivitas enzim dari sampel tersebut. Uji yang digunakan untuk menentukan berat molekul dari enzim yang diekstraksi adalah uji menggunakan SDS-PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate -- Polyacrylamide Gel Electrophoresis. 

Gel yang digunakan mengandung 12% acrylamide dan marker LMW (Low Molecular Weight). Buffer yang digunakan sama dengan proses zimogram, yaitu menggunakan buffer 2-mercaptoethanol. Di dalam larutan buffer tersebut, gel dilewati perlakuan panas selama 3 sampai 5 menti pada suhu 95oC. 

Pada setiap well dimasukkan sampel sebesar 10 L dan dilakukan elektroforesis selama 1.5 jam dengan kekuatan 100 Volt dan 50 Ampere. Hasil akhirnya akan divisualisasikan menggunakan pewarna CBB R-250. Metode ini juga dapat menganalisis aktivitas enzim fibrinolitik dengan memanfaatkan hidrolisis fibrinogen. 

Enzim yang telah dipurifikasi diambil sebanyak 0.02 g dan dicampurkan dengan 2 mg fibrinogen dalam 500 L Tris-HCl 20 mM pada pH 8. Campuran tersebut diinkubasi di suhu 37oC selama 0 hingga 90 menit dan diambil 20 L sampel per 15 menit dan dianalisis dengan SDS-PAGE (Johnson et al. 2015).

Meskipun telah dilakukan analisis aktivitas enzim fibrinolitik menggunakan SDS-PAGE, untuk mengkonfirmasi, digunakan metode lain, yaitu fibrin plate assay. Pengujian ini memanfaatkan media agar berisi 2% w/v agarose, 0.1 mL 100 NIH thrombin, dan 7 mL fibrinogen 0.3% w/v dalam 50mM buffer fosfat pH 7.8. Sebanyak 10 L sampel dituang ke dalam agar dan diikubasi selama 3 jam pada suhu 37oC. Hasilnya ditunjukkan dari terbentuknya zona bening pada media (Johnson et al. 2015).

Dari berbagai macam langkah yang telah dilakukan, dihasilkan bahwa enzim fibrinolitik yang diinkubasi dari nira dan tuak aren, terdapat salah satu strain yang dapat dimanfaatkan sebagai produksi enzim fibrinolitik, yaitu strain T2 dari tuak aren. Berat molekul enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh tuak aren cukup kecil, yaitu sekitar 26 hingga 28 kDa. 

Enzim fibrinolitik yang diekstraksi dapat digunakan sebagai sumber pangan fungsional. Terutama, enzim fibrinolitik yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut termasuk dalam kategori mikroorganisme GRAS atau Generally Recognized as Safe, artinya mikroorganisme tersebut umumnya tergolong sebagai mikroorganisme yang tidak berbahaya. 

Jika diekstraksi, enzim fibrinolitik dapat digunakan menjadi oabt -- obatan atau bahan tambahan pangan (Johnson et al. 2015). Terdapat juga penelitian menggunakan enzim fibrinolitik sebagai terapi anti-trombosis untuk menghindari komplikasi seperti, pendarahan, penggumpalan darah, dan alergi yang kadangkala terjadi akibat efek samping dari pengobatan trombosis pada umumnya (Altaf et al. 2021).

Ternyata menarik banget ya dari minuman fermentasi khas Indonesia, tuak aren, meskipun beralkohol tapi memiliki khasiat di dalamnya karena mengandung enzim fibrinolitik. Terutama enzim tersebut bisa diekstraksi dan dipurifikasi untuk membentuk inovasi -- inovasi produk baru yang khususnya bertujuan untuk kesehatan karena efeknya yang dapat mencegah pembekuan darah di pembuluh darah arteri.  

Sumber:

Altaf F, Wu S, Kasim V. 2021. Role of fibrinolytic enzymes in anti-thrombosis therapy. Frontier in Moleculer Biosciences. 8(680397): 1 -- 17.

Johnson, Yanti, Suhartono MT, Lay BW. 2015. Isolation and purification of a fibrinolytic enzyme from bacterial strain isolated from tuak, an indonesian palm wine. International J of Pharma and Bio Sciences. 6(4): (B) 988 -- 996.

Pananjung AMS, Ulfa EU, Senjarini K, Arimurti S. 2015. Karakterisasi isolat bakteri fibrinolitik wu 021055* asal perairan pantai papuma, jember. J Bioteknologi & Biosains Indonesia. 2(1): 1 -- 8.