Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies anggrek langka dan endemik di India menggunakan teknik DNA barcoding. Proses dimulai dengan pengambilan daun anggrek yang sehat, kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan menggunakan silika gel dalam botol gelap selama 7--10 hari. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB. Kualitas DNA yang dihasilkan diuji dengan elektroforesis gel agarosa dan divisualisasikan menggunakan transilluminator UV, sementara kuantitas DNA diuji dengan spektrofotometer. Hanya DNA dengan rasio 260/280 lebih dari 1,6 yang digunakan dalam tahap selanjutnya.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan primer universal untuk empat lokus utama: ITS, matK, rbcL, dan trnH-psbA. Produk PCR yang dihasilkan kemudian dimurnikan menggunakan GenElute PCR Clean-Up Kit dan disimpan pada suhu 20C sebelum dilakukan sekuensing. Proses pengurutan DNA dilakukan menggunakan metode Sanger melalui DNA Analyzer tipe 3730xl.
Keberhasilan proses amplifikasi dan sekuensing dinilai berdasarkan persentase produk PCR yang berhasil diperoleh serta jumlah sekuens berkualitas tinggi. Sekuens DNA yang diperoleh disejajarkan menggunakan perangkat lunak ClustalX 2.1 dan diserahkan ke basis data GenBank. Untuk menentukan barcode DNA yang paling sesuai, setiap sekuens lokus dianalisis menggunakan model Kimura two-parameter (K2P) pada software MEGA X. Analisis ini digunakan untuk menghitung jarak genetik antar individu dan menilai perbedaan antara variasi dalam spesies (intra-spesifik) dan antar spesies (inter-spesifik). Barcode kandidat ditetapkan jika terdapat "barcoding gap", yaitu tidak adanya tumpang tindih antara jarak intra- dan inter-spesifik.
Selanjutnya, dilakukan analisis BLAST untuk membandingkan sekuens hasil penelitian dengan data di GenBank, guna memastikan identitas spesies berdasarkan kemiripan sekuens. Terakhir, analisis filogenetik dilakukan menggunakan metode Maximum Likelihood (ML) dengan 100 kali bootstrap pada MEGA X. Hasil pohon filogenetik dibandingkan dengan data taksonomi yang sudah ada untuk memverifikasi validitas identifikasi spesies melalui pendekatan DNA barcoding.
Hasil Penelitian
Keberhasilan amplifikasi PCR:
