Mengenal Anggrek Langka dengan Teknologi DNA Barcoding

Oleh: Cheryl Dwi Nur Zahra, De Shila Syailinda Maulida, dan Lastri Leonita

Kenapa Harus Anggrek?

Anggrek memiliki jenis beragam dan tersebar di seluruh dunia dengan nilai ekonomi yang tinggi serta kaya akan manfaat. Meskipun anggrek memiliki banyak manfaat dan merupakan anggota dari tanaman obat-obatan herbal, kosmetik, perasa dan wewangian anggrek sering kali diabaikan para pedagang maupun peneliti karena kurangnya metode penyerbukan dan kondisi iklim yang tidak mendukung. (Kayalvizhi et al., 2020). Selain itu, penggundulan hutan serta pemanenan anggrek secara ilegal menjadi ancaman serius terhadap kelangsungan hidup anggrek yang terancam punah. Maka dari itu diperlukan identifikasi spesies yang terancam punah diperlukan  untuk perencanaan dan pengelolaan metode konservasi in situ dan ex situ. (Bhutia et al., 2023).

DNA Barcoding: Teknologi Identifikasi

DNA barcoding adalah metode untuk mengenali spesies berdasarkan urutan DNA pendek yang khas dan spesifik. Teknik ini berfungsi seperti "kode batang" di supermarket setiap spesies punya pola DNA yang bisa dipindai.

Teknologi barcode DNA dikembangkan untuk identifikasi spesies anggrek dengan cepat dan akurat untuk mempercepat konservasi dan komersialisasi  anggrek endemik dan langka. Berbagai eksperimen juga telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen-gen yang spesifik dan daerah genom yang dapat berfungsi sebagai barcode DNA. Kelompok kerja Konsorsium untuk Barcode Kehidupan telah mengusulkan gen plasmid seperti rbcL dan matK sebagai kode batang universal untuk tanaman darat, selain penanda  plasmid, gen plastida yang dikonversi seperti  accD, ndhJ, rpoB, rpoC1, dan ycf5; daerah spacer intergenik plastida trnHpsbA, atpFatpH dan psbKpsbl; dan daerah spacer transkrip internal ribosom nuklir: ITS (ITS1+5.8S+ITS2), ITS1, and ITS2 juga ditemukan sebagai daerah barcode DNA untuk identifikasi tanaman. 

Riset di India: Menyelamatkan Anggrek dengan Genetika

Penelitian oleh Srivastava (2020) mengumpulkan 62 sampel anggrek dari 35 spesies berbeda, tersebar di wilayah: Kerala, Karnataka, Maharashtra,  Assam, Nagaland; dan Tamilnadu. Sampel lapangan diidentifikasi oleh Dr. K. Sashidhar, Presiden "The Orchid Society of Karnataka" (TOSKAR), berdasarkan karakter reproduktif dan vegetatif. Spesimen selanjutnya dibuat herbarium diawetkan di Departemen Mikrobiologi dan Bioteknologi Universitas Bangalore, Bengaluru, India. 

Metodologi Lengkap

Metode

Metode 

Metode

Metode

Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi spesies anggrek langka dan endemik di India menggunakan teknik DNA barcoding. Proses dimulai dengan pengambilan daun anggrek yang sehat, kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan menggunakan silika gel dalam botol gelap selama 7--10 hari. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode CTAB. Kualitas DNA yang dihasilkan diuji dengan elektroforesis gel agarosa dan divisualisasikan menggunakan transilluminator UV, sementara kuantitas DNA diuji dengan spektrofotometer. Hanya DNA dengan rasio 260/280 lebih dari 1,6 yang digunakan dalam tahap selanjutnya.

Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan primer universal untuk empat lokus utama: ITS, matK, rbcL, dan trnH-psbA. Produk PCR yang dihasilkan kemudian dimurnikan menggunakan GenElute PCR Clean-Up Kit dan disimpan pada suhu 20C sebelum dilakukan sekuensing. Proses pengurutan DNA dilakukan menggunakan metode Sanger melalui DNA Analyzer tipe 3730xl.

Keberhasilan proses amplifikasi dan sekuensing dinilai berdasarkan persentase produk PCR yang berhasil diperoleh serta jumlah sekuens berkualitas tinggi. Sekuens DNA yang diperoleh disejajarkan menggunakan perangkat lunak ClustalX 2.1 dan diserahkan ke basis data GenBank. Untuk menentukan barcode DNA yang paling sesuai, setiap sekuens lokus dianalisis menggunakan model Kimura two-parameter (K2P) pada software MEGA X. Analisis ini digunakan untuk menghitung jarak genetik antar individu dan menilai perbedaan antara variasi dalam spesies (intra-spesifik) dan antar spesies (inter-spesifik). Barcode kandidat ditetapkan jika terdapat "barcoding gap", yaitu tidak adanya tumpang tindih antara jarak intra- dan inter-spesifik.

Selanjutnya, dilakukan analisis BLAST untuk membandingkan sekuens hasil penelitian dengan data di GenBank, guna memastikan identitas spesies berdasarkan kemiripan sekuens. Terakhir, analisis filogenetik dilakukan menggunakan metode Maximum Likelihood (ML) dengan 100 kali bootstrap pada MEGA X. Hasil pohon filogenetik dibandingkan dengan data taksonomi yang sudah ada untuk memverifikasi validitas identifikasi spesies melalui pendekatan DNA barcoding.

Hasil Penelitian

Keberhasilan amplifikasi PCR:

• ITS: 97%

• matK: 100%

• rbcL: 100%

• trnH-psbA: 41% (tidak dipakai lebih lanjut)

Setelah sekuensing:

• ITS: 93%

• matK: 100%

• rbcL: 98%

• trnH-psbA: 25%

Temuan Baru:

Penelitian berhasil memperkenalkan data genetik baru dari 10 spesies endemik Ghat Barat yang sebelumnya belum pernah tercatat di basis data global, yaitu: Bulbophyllum acutiflorum, Bulbophyllum fimbriatum, Bulbophyllum  fuscopurpureum, Bulbophyllum mysorense, Bulbophyllum tremulum, Coelogyne mossiae, Coelogyne odoratissima, Dendrobium panduratum, Trias stocksii, dan Trias bonaccordensis.

Tabel Perbandingan Evaluasi Penanda DNA

ITS unggul karena:

• Memiliki divergensi interspesifik tertinggi (hingga 0,3765)

• Memiliki intraspesifik divergence yang tetap terpisah (tidak tumpang tindih)

• Hasil pohon filogenetik konsisten dengan klasifikasi taksonomi (bootstrap > 89%). Misalnya, pada gambar 1 menunjukkan bahwa spesies Coelogyne nervosa dan C. pandurata masing-masing membentuk kelompok tersendiri dengan nilai bootstrap yang kuat. Ini menunjukkan bahwa ITS mampu menggambarkan hubungan antar spesies sesuai dengan klasifikasi taksonomi yang berlaku. Sebaliknya, pada gambar 2 dan 3 yang menggunakan penanda matK dan rbcL menghasilkan pohon dengan struktur lemah, bahkan mencampur spesies dari genus atau subfamili yang berbeda, seperti Paphiopedilum dan Bulbophyllum, yang semestinya tidak berkerabat dekat.

Gambar 1. Pohon ML menggunakan barcode DNA ITS

Gambar 2. Pohon ML menggunakan barcode DNA matK

Gambar 3. Pohon ML menggunakan barcode DNA rbcL

 

Studi Serupa Mendukung ITS

Walau ITS tidak selalu cocok untuk melihat hubungan antar kelompok besar tumbuhan, bagian ini sangat berguna untuk membedakan spesies yang masih dalam satu kelompok kecil, seperti satu genus atau bahkan varietas dalam satu spesies.

Penelitian-penelitian sebelumnya pada anggrek seperti Dendrobium, Habenaria, dan Paphiopedilum juga membuktikan bahwa ITS memang efektif digunakan. Bahkan, kelompok peneliti internasional dari China juga menyarankan ITS (atau bagian dari ITS yang disebut ITS2) dimasukkan ke dalam barcode utama untuk tanaman berbunga, karena hasilnya yang sangat menjanjikan.

Namun, dalam penelitian ini, dua penanda DNA lain yaitu matK dan rbcL tidak berhasil membedakan anggrek-anggrek India yang diteliti. Mungkin karena spesies yang diuji sangat mirip satu sama lain, sehingga hanya ITS yang cukup sensitif untuk menangkap perbedaannya.

Kesimpulan

Penelitian ini melibatkan 62 sampel dari 35 spesies anggrek langka dan endemik India yang berasal dari 7 genera, dan berhasil memperkenalkan 10 spesies anggrek dari kawasan Western Ghats yang sebelumnya belum tercatat dalam basis data ilmiah global. Sebanyak 133 urutan DNA barcoding berhasil diidentifikasi, dengan 20 urutan ITS, 12 matK, dan 14 rbcL yang merupakan data baru bagi database GenBank. Berdasarkan analisis jarak genetik, pencocokan BLAST, dan pohon filogenetik, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa wilayah ITS merupakan penanda DNA paling akurat dan efektif sebagai barcode tunggal untuk mengidentifikasi spesies anggrek di India.

Daftar Pustaka

Artikel Utama 

Srivastava, D., Srivastava, D., & Manjunath, K. (2020). DNA Barcoding of Endemic and Endangered Orchids of India: A Molecular Method of Species Identification. Pharmacognosy Magazine, 16(70). 10.4103/pm.pm_510_19

Artikel Pendukung 

Bhutia, T. L., Bhutia, N. T., Sailo, N., & Bhutia, T. C. (2023). Ex situ conservation of rare and threatened orchid: Diplomeris hirsuta (Lindl.). Journal of Applied Horticulture, 25(02), 120--122. https://doi.org/10.37855/jah.2023.v25i02.21

Kayalvizhi, K., Divya, K., & Sankari, A. (2020). Medicinal Orchids -- An Overview. 2(10), 1084--1087.s