5. Transformasi Genetik
Transforamsi genetik merupakan proses pemasukan DNA asing ke dalam sel organisme agar sel tersebut dapat mengekspresikan gen baru. Transformasi genetik dilakukan dengan DNA rekombinan dimasukkan dalam sel target, sehingga sel tersebut memperoleh kemampuan ekspresi gen baru. Metode ini bergantung pada jenis sel misalnya pada bakteri, digunakan bantuan seperti agen CaCl untuk membuka pori membran, atau elektroporasi untuk mempercepat masuknya DNA. Disamping bakteri pada sel eukariot, digunakan teknik mikroinjeksi ke dalam inti sel, atau biobalistik, di mana partikel emas atau tungsten yang mengandung DNA ditembakkan ke sel menggunakan tekanan gas. Kemudian pada tanaman dilakukan proses transformasi dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens yang secara alami mentransfer DNA ke sel tumbuhan melalui plasmid Ti.
DNA asing yang berhasil masuk ke dalam sel akan menempel di genom atau bereplikasi secara episomal, dan gen tersebut mulai terekspresi, menghasilkan protein baru yang dapat diamati secara fenotipik atau dikonfirmasi dengan teknik molekuler. Sehingga, transformasi genetik memungkinkan modifikasi sifat organisme untuk aplikasi seperti peningkatan ketahanan tanaman atau terapi gen pada manusia.
6. CRISPR-Cas9
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 atau CRISPR-Cas9 merupakan sistem pengeditan gen yang menggunakan guide RNA (gRNA) dalam mengenali urutan DNA target dan bantuan enzim Cas9 sebagai pemotong spesifik. Adapun mekanisme dari CRISPR ini secara lengkap dapat dijabarkan sebagai berikut,
Desain gRNA
Proses ini dilakukan perancangan gRNA yang memiliki urutan nukleotida komplementer terhadap gen target dalam genom. Urutan ini harus berada di dekat motif protospacer adjacent motif (PAM), biasanya 5'-NGG-3' bagi Cas9 dari Streptococcus pyogenes.
Pengiriman Sistem ke dalam Sel
Sistem CRISPR-Cas9 dapat dimasukkan ke dalam sel melalui beberapa metode, antara lain:
- Plasmid: vektor DNA rekombinan yang mengkode gRNA dan Cas9.
- mRNA: langsung mentranskripsi Cas9 dan gRNA dalam sel.
- RNP complex: kompleks Cas9 protein dan gRNA siap pakai, bekerja lebih cepat dan minim efek samping.
Pengikatan dan Pemotongan DNA Target
Setelah di dalam sel, gRNA akan mencari dan berikatan dengan urutan target DNA yang cocok. Enzim Cas9 kemudian diposisikan untuk memotong kedua untai DNA tepat pada lokasi target, menciptakan double-strand break (DSB).
