Edukasi Pilihan

Transformasi Gen Nilam untuk Ketahanan terhadap Penyakit

19 Desember 2018   11:00 Diperbarui: 19 Desember 2018   12:24 134 0 0

Indonesia  merupakan  penghasil  utama minyak  nilam  yang  memasok  lebih  dari  80%  kebutuhan dunia. Salah satu masalah  dalam  budidaya  nilam  di  Indonesia  adalah  adanya  serangan  penyakit  tanaman. Beberapa  penyakit  utama  pada  tanaman  nilam adalah penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia  solanacearum, penyakit  budok  yang  disebabkan  oleh  jamur Synchytrium  pogostemonis nematode, dan  penyakit  yang  disebabkan  oleh  virus. Penggunaan varietas tahan adalah cara yang paling efektif untuk mengendalikan penyakit tanaman. 

Transformasi  genetik  dengan  gen  asing  dari tanaman  lain  merupakan  cara  alternatif  untuk memperoleh  tanaman  yang  memiliki  sifat  yang diinginkan.

Metode transfer gen dari tanaman satu ke tanaman  lain  telah  banyak  dilakukan  antara  lain menggunakan  Agrobacterium  tumefaciens. Metode ini  sangat  sederhana  dan  murah  karena  pada prinsipnya  gen  yang  akan  dipindahkan  disisipkan ke plasmid T-DNA A.  tumefaciens, lalu diinokulasikan  ke  jaringan  tanaman  yang  telah  dilukai. \

Namun  keberhasilan  transformasi  dengan  A. tumefaciens tergantung  pada  jenis  tanaman, strain  Agrobacterium,  vektor  plasmid,  medium transformasi dan suhu lingkungan. Protokol  transformasi  gen dengan  metode  ATMT  (Agrobacterium  tumefaciens-mediated transformation) belum banyak tersedia  pada  tanaman  obat  dan  atsiri.

Tanaman  nilam  merupakan  tanaman  aromatik  yang  dapat  berfungsi  sebagai  antibakteri seperti  terhadap  Bacillus  subtilis,  Staphylococcus aureus,  Streptococcus  pyogenes,  Enterobacter aerogenes,  Pseudomonas  aeruginosa,  Escherichia coli,  Klebsiella  pneumoniae dan  Serratia  marcescens. Keberadaan antibakteri ini pada  tanaman  nilam  diduga  akan  mempengaruhi bakteri A. tumefacienspada saat transformasi. 

Bakteri  Agrobacterium yang  membawa konstruk  pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 dikulturkan  dalam  media  YEP  padat  (Yeast  Extract Pepton)  yang  mengandung  100  mg.l-1 kanamisin dan 10 mg.l-1 rifampisin. Kultur bakteri diinkubasi pada  suhu  28 C  selama  2  hari  dengan  penggoyangan.  Kultur  Agrobacterium yang  telah  tumbuh  pada  media  padat  selanjutnya  dikulturkan dalam  media  AAM  (media  AA  modified untuk infeksi  Agrobacterium)  (Hiei  et  al.  1994),  tanpa antibiotik  dan  dikocok  menggunakan  shaker selama 1-2 jam.
 

Isolasi DNA untuk analisis PCR dilakukan dari daun yang diambil dari tanaman nilam hasil aklimatisasi. DNA  genom  total  nilam  diisolasi  dengan menggunakan  metode  CTAB  (Cetyltrimethylammonium  bromida). Pelet  DNA  dilarutkan  dengan  50  l  TE buffer.  Sampel  DNA  nilam  hasil  isolasi  siap diamplifikasi  menggunakan  PCR  atau  disimpan pada suhu -20 C. Proses pemanjangan/sintesis  DNA  akhir  pada  suhu  72 C  selama  5  menit.  Setelah  program  PCR  selesai selanjutnya dilakukan elektroforesis hasil PCR. Jumlah  kalus  yang  dapat  mencapai  tahap regenerasi  semakin  menurun,  setelah  dilakukan transformasi. 

Kalus yang tidak tahan pada medium seleksi  yang  mengandung  antibiotik  higromisin akan  mati,  ditunjukkan  dengan  perubahan  warna kalus dari putih pucat menjadi hitam. Hasil  analisis  PCR  menunjukkan  bahwa dari  22  galur  independen  yang  dianalisis,  lima galur  independen  (T1,  T8,  T10,  T11,  dan  T13) mengandung  gen  penanda  seleksi  higromisin (hptII)  yang  diindikasikan  dengan  terbentuknya amplikon  berukuran  500  bp. Hasil  ini menunjukkan  bahwa  gen  WRKY76 yang  diisolasi dari  tanaman  padi  dapat  diintegrasikan  pada tanaman  nilam  dengan  bantuan  vektor  A.  tumefaciens. Penggunaan  A.  tumefaciens untuk  transfer  gen  PaMMV  coat  protein (CP)  pada  tanaman nilam telah dilakukan, dan menghasilkan tanaman yang  tahan  terhadap  virus  yaitu  Patchouli  mild mosaic virus.

Syarat  utama  dalam  perbaikan  genetik tanaman  melalui  rekayasa  genetik  dengan  memanfaatkan  teknik  in  vitro adalah  penguasaan protokol  regenerasi. Protokol  regenerasi  in  vitro transgenik  (T1,  T8,  T10,  T11,  T13)  teramplifikasi dengan  primer  spesifik  gen  hptII,  dan  berpeluang menjadi kandidat varietas tahan terhadap penyakit utama pada tanaman nilam. 

Tanaman  nilam  sudah  tersedia,  selain  itu  secara konvensional  nilam  diperbanyak  secara  vegetatif dengan  setek.  Oleh  karena  itu,  sekali  diperoleh nilam transgenik dengan karakter yang diinginkan, maka  tanaman  transgenik  tersebut  tinggal  diperbanyak  secara  vegetatif  tanpa  terjadi  perubahan genetik. Transformasi  gen  pada  tanaman  nilam (varietas  Sidikalang)  dapat  dilakukan  dengan menggunakan vektor  Agrobacterium tumefaciens.

https://www.researchgate.net/publication/317443585_TRANSFORMASI_GEN_PADA_NILAM_UNTUK_KETAHANAN_TERHADAP_PENYAKIT_UTAMA_MENGGUNAKAN_Agrobacterium_tumefaciens