Tonggak penting dalam bioteknologi modern yang saat ini viral yaitu Rekayasa genetika yang memungkinkan manusia memahami, memodifikasi, dan mengarahkan kode genetik organisme hidup dan merevolusi berbagai bidang, mulai dari pengobatan, pertanian, hingga lingkungan. Dalam rekayasa genetika, ilmuwan dapat mengambil gen tertentu dari suatu organisme, memperbanyaknya, memisahkannya berdasarkan karakteristik fisiknya, hingga menyunting urutan genetik dengan alat presisi seperti CRISPR-Cas9. Artikel ini akan membahas mengenai teknik-teknik dasar dalam rekayasa genetika, termasuk isolasi gen, kloning, PCR, elektroforesis, transformasi genetik, hingga teknologi pengeditan gen modern secara komprehensif
1. Isolasi Gen
Proses ini memiliki tujuan untuk menghancurkan membran sel dan menghilangankan protein pengikat DNA. Teknik ini diawali dengan dilakukan ekstraksi DNA dari sel organisme menggunakan larutan lisis yang mengandung deterjen dan enzim proteolitik sebelum gen target diidentifikasi berdasarkan urutan nukleotida spesifik menggunakan probe atau primer komplementer. Kemudian setelah proses tersebut dilanjutkan proses menggunakan enzim restriksi untuk memotong DNA pada lokasi tertentu yang mengapit gen target. Potongan DNA ini kemudian dimurnikan menggunakan sentifugasi gradien atau kromatografi kolom, yang nantinya menghasilkan fragmen gen yang telah terpisah dari kontaminan biologis. Sehingga, gen yang telah diisolasi dapat digunakan untuk proses selanjutnya seperti kloning atau ekspresi.
2. Kloning Gen
Teknik ini merupakan teknik dalam bioteknologi dengan memungkinkan perbanyakan gen secara eksponensial dalam sistem. Proses kloning gen diawali dengan menyisipkan gen hasil isolasi ke dalam vektor plasmid yang memiliki fitur-fitur pendukung seperti situs kloning dan gen seleksi (misalnya gen resistensi antibiotik). Penyisipan tersebut dilakukan menggunakan enzim ligase DNA yang menyambung gen target ke plasmid sehingga dapat membentuk DNA rekombinan. Vektor ini kemudian dimasukkan ke dalam sel inang yang biasanya adalah Escherichia coli, melalui proses transformasi seperti perlakuan kalsium klorida atau elektroporasi. Sel inang akan mereplikasi plasmid secara mandiri, menghasilkan jutaan kopi gen target. Koloni yang berhasil mentransformasi vektor akan tumbuh di media selektif (misalnya LB agar dengan ampisilin), sehingga menghasilkan populasi sel yang membawa gen baru. Maka, kloning gen memungkinkan perbanyakan dan pemeliharaan gen dalam sistem biologis hidup yang stabil.
3. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR adalah teknik amplifikasi in vitro yang memungkinkan perbanyakan fragmen DNA secara selektif dengan efisiensi tinggi. Teknik ini banyak digunaknan dalam berbagai aplikasi bioteknologi seperti diagnostik molekuler, identifikasi genetik, forensik, evolusi molekuler, dan riset genom. PCR dilakukan dengan menyiapkan campuran reaksi yang terdiri dari DNA template, primer komplementer terhadap gen target, nukleotida bebas, dan enzim Taq DNA polymerase. Campuran ini dimasukkan ke dalam termocycler yang menjalankan tiga fase suhu berulang, yang dapat dijabarkan sebagai berikut
- Denaturasi (95C): Pada tahap ini, suhu tinggi memecah ikatan hidrogen antara pasangan basa pada DNA rantai ganda sehingga menjadi dua untai tunggal. Hal ini penting agar primer dapat berikatan dengan urutan spesifik di template.
- Annealing (50--65C): Suhu diturunkan agar primer dapat mengenali dan menempel pada lokasi komplementer di kedua untai DNA. Suhu ini harus disesuaikan dengan titik leleh (Tm) masing-masing primer agar ikatan spesifik terbentuk tanpa ikatan non-spesifik.
- Ekstensi (72C): Pada suhu optimal ini, Taq polymerase mulai bekerja dengan menambahkan nukleotida bebas ke ujung 3' dari primer, memperpanjangnya sepanjang template. Hasilnya adalah terbentuk satu salinan baru dari fragmen DNA target.
Proses ini diulang selama puluhan siklus dan akan menghasilkan amplifikasi eksponensial dari fragmen DNA target. Sehingga, hanya dengan sampel kecil, PCR mampu menghasilkan jutaan kopi DNA dalam hitungan jam, sangat berguna dalam diagnostik, identifikasi, dan kloning molekuler.
4. Elektroforesis DNA
Teknik yang dilakukan di laboratorium ini digunakan dalam memidahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran menggunakan medan listrik. Langkah awalnya setelah DNA diperoleh atau diperbanyak, yaitu DNA dimasukkan ke dalam gel agarosa yang memiliki pori-pori mikroskopis, kemudian dikenakan medan listrik menggunakan larutan buffer. Karena DNA bermuatan negatif, ia akan bergerak ke arah kutub positif. Fragmen kecil bergerak lebih cepat dan lebih jauh, sedangkan fragmen besar tertahan di awal gel. Setelah proses selesai, gel direndam dalam zat pewarna seperti etidium bromida yang mengikat DNA dan memancarkan cahaya di bawah sinar UV yang nantinya dapat menghasilkan pita-pita DNA yang dapat dibandingkan dengan penanda ukuran (DNA ladder), memungkinkan identifikasi dan verifikasi keberhasilan PCR atau kloning.
